天然产物改造显威力！！！！Adv Sci：小檗碱衍生物B68双靶BMI1/CSN5，，，为肿瘤免疫治疗提供新候选

在癌症治疗领域
，，，寻找高效且低副作用的治疗策略始终是科研人员不懈努力的方向。。。小檗碱，，，作为一种从植物中提取的天然生物碱
，，近年来因其广泛的药理活性备受关注，，尤其是在抗癌方面展现出巨大潜力。。。。今天和大家分享一篇关于聚焦小檗碱衍生物B68在肿瘤治疗领域探索的文章，，该文章于2024年12月发表在Advanced Science杂志上，，标题为“Berberine Derivative B68 Promotes Tumor Immune Clearance by Dual‐Targeting BMI1 for Senescence Induction and CSN5 for PD‐L1 Degradation”。。

01. 研究思路

该研究围绕“解决肿瘤衰老诱导与免疫逃逸矛盾”展开
，，以技术为核心驱动力推进探索：先通过小檗碱母核结构修饰，，，结合CCK-8、、、、集落形成实验筛选出高抑瘤活性（RKO 细胞 IC50 1.03 μm）且低毒的衍生物B68；细胞机制解析阶段，，用转录组加蛋白质组测序锁定“细胞周期”“p53信号通路”，，，
，借 DARTS、、、pull-down结合proteomics交叉分析筛选BMI1
、、CSN5靶点
，，再经CETSA、、
、、MST及分子对接验证B68与BMI1（Arg123 位点，，
，Kd=91.4 nm）、、、CSN5（Glu76 位点）直接结合，，通过基因敲除
、、、、CHX/MG132干预实验明确其诱导细胞衰老及降解PD-L1的机制；体内验证环节，，，构建裸鼠移植瘤、、AOM/DSS化学诱导结直肠癌、、、、免疫正常小鼠MC38移植瘤模型，，，用SA-β-gal染色、
、、IHC、、WB证实抑瘤效果，，，流式细胞术分析免疫细胞浸润验证免疫激活及与抗CTLA4协同增效
，，，结合DC细胞成熟标志物检测探索免疫原性；最后通过人类结直肠癌组织WB、、、、免疫荧光检测及TCGA/TIMER 2.0数据库生存与相关性分析
，
，，，佐证靶点临床价值，，
，，全程以多元技术层层递进验证B68双靶向抗癌机制，
，为相关肿瘤治疗及B68临床前研究奠定基础。
。

02. 主要研究内容

（1）B68通过靶向BMI1诱导结直肠癌细胞衰老

为探究B68诱导结直肠癌细胞衰老的分子机制，
，先对B68处理的RKO细胞做转录组测序：KEGG 分析显示“细胞周期”“p53信号通路”“细胞衰老通路”为Top3富集通路（匹配衰老表型），
，GO分析进一步证实衰老通路激活
；B68处理组1050个基因mRNA上调、、、1221个下调，，其中CXCL8
、、、TP53等衰老相关基因上调，
，
，CCNA2、、、FOXM1等下调。。。同步开展的蛋白质组分析也显示这三条通路最富集
，，，，且CCND3、、、RBL2等衰老相关蛋白表达显著变化，，，，共同确认B68通过调控衰老通路起效。。。。筛选靶点时，，
，DARTS技术预测33个潜在结合蛋白（unique peptide≥2
，，
，，强度比≥1.5）；合成生物素标记B68（Bio-B68，，
，可诱导RKO衰老），，，，经pull-down结合质谱获得15个靶点。。。。整合多组学结果得4个候选基因
，，，基因干扰实验仅敲低BMI1诱导衰老
，
，
，确定其为核心靶点
。。在验证阶段：免疫印迹显示B68以时间/浓度依赖性降RKO、
、HCT116细胞BMI1蛋白（不影响mRNA）
，，提示降解机制
；敲除BMI1后，，，细胞经SA-β-gal染色、、、p53/p21检测、、、H3K9me3免疫荧光均显衰老，
，且B68无法再诱导衰老，
，证实B68依赖BMI1诱导衰老。。
。

（2）BMI1的Arg123位点对结合B68至关重要

用细胞热转移实验CETSA证实B68在37-83℃增强BMI1热稳定性，
，，，65℃及酶-裂解液1:300条件下均观察到BMI1积累随B68浓度升高而增加，，，佐证二者直接结合；再经Maestro软件（Schrödinger 9.0）分子对接模拟、、、、MST检测（Kd=91.4 nm）
，，
，，发现BMI1的Glu120和Arg123与B68形成氢键
，，
，细胞MST实验显示Arg123突变完全阻断复合物形成，，证实其为关键结合位点；此外，
，免疫印迹显示 B68以时间/浓度依赖性降低BMI1蛋白（不影响mRNA），，敲除BMI1后细胞显衰老且B68无法再诱导，，，最终证实B68依赖结合BMI1的Arg123位点，，
，，诱导结直肠癌细胞衰老。。。

（3）B68通过靶向CSN5介导PD-L1降解

鉴于小檗碱可通过调控PD-L1表达发挥抗肿瘤免疫作用，，，研究人员对化合物B68展开探究，，通过WB、、流式细胞术、、免疫荧光实验验证B68能以剂量依赖性方式降低结直肠癌细胞系（RKO 和 HCT116）中PD-L1的表达，，，，进而减少癌细胞与PD-1的结合能力，，
，
，且在与T细胞共培养实验中可剂量依赖性降低上述癌细胞活性，，，
，表明其能通过下调PD-L1发挥抗肿瘤免疫作用；机制研究发现，，
，B68不影响PD-L1 的转录水平（PD-L1 mRNA 无变化），，，，而是通过翻译后修饰调控其表达，，具体为依赖泛素-蛋白酶体途径（蛋白酶体抑制剂MG132可逆转B68诱导的PD-L1降解，，，，自噬抑制剂则无此效果
，
，，，且B68可增加 PD-L1泛素化水平）；分子对接、、、微量热泳动（MST）及免疫沉淀（IP）实验进一步证实，，B68通过靶向CSN5蛋白的Glu76位点，，，结合CSN5与PD-L1的相互作用，
，，，最终介导PD-L1的泛素化降解。。。
。

03. 参考文献