从机制到靶点：PPDPF介导的GTP转移，，，，为KRAS突变胰腺癌提供新疗法方向

从机制到靶点：PPDPF介导的GTP转移，，，为KRAS突变胰腺癌提供新疗法方向

在恶性肿瘤领域
，，，
，被称为“癌王”的胰腺导管腺癌（PDAC）因其恶性程度高、
、、、早期诊断难、
、、、预后极差而备受关注。。。。其中，，KRAS基因突变被认为是驱动PDAC发生发展的核心引擎，，约90%的PDAC患者存在KRAS突变
，，但其靶向治疗一直是临床和科研领域的难题。。

今天和大家分享一篇关于胰腺导管腺癌（PDAC）中KRAS突变驱动的恶性进展机制的文章，
，该文章于2022年12月发表在Advanced Science杂志上，
，标题为“PPDPF Promotes the Development of Mutant KRAS‐Driven Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Regulating the GEF Activity of SOS1”。。。

01研究思路

该研究围绕PPDPF在突变KRAS驱动的胰腺导管腺癌（PDAC）中的作用展开，，，通过一系列精准技术手段逐步揭示其机制
：首先利用RT-qPCR和组织芯片免疫组化技术，
，
，在55对临床样本中证实PPDPF在PDAC组织中mRNA和蛋白水平均显著高表达，
，
，且结合Kaplan-Meier生存分析与临床病理关联分析，，，，明确其与肿瘤进展及不良预后的相关性；随后通过基因编辑技术构建PPDPF过表达和敲除细胞系，，结合MTT、、
、、克隆形成
、、、、软琼脂等细胞功能实验，，以及裸鼠皮下移植瘤和胰腺原位移植模型，，在体内外验证其对PDAC细胞增殖和肿瘤发生的促进作用；在KRASG12D驱动的遗传小鼠模型中，，通过胰腺特异性敲除技术进一步证实PPDPF对肿瘤发展的关键作用。。。
。机制探究中
，，
，，采用Co-IP和GST pulldown技术验证PPDPF与SOS1的直接相互作用，，并通过截短体突变实验定位结合区域为SOS1的催化结构域（REM 和CDC25域）；利用GST-RBD pulldown技术检测KRAS-GTP水平，，
，结合Western blot分析p-ERK信号，，
，明确PPDPF对RAS/MAPK通路的激活效应；通过GTP结合实验和微量热泳动（MST）技术证实PPDPF 的GTP结合能力，
，借助质谱鉴定其关键结合位点（Ser6/7），，
，并构建位点突变体验证GTP结合对其功能的必要性
；最终通过体外GTP转移实验和SOS1关键区域突变体（R1/R2）功能验证，，揭示PPDPF通过将GTP转移至SOS1增强其GEF活性，，，，进而激活KRAS的全新机制
，，为PDAC治疗提供了基于该调控轴的潜在靶点。。

02主要研究内容

（1）PPDPF 的促肿瘤作用依赖于 SOS1 的鸟苷酸交换因子（GEF）活性

利用Co-IP实验在293T细胞和Miapaca2细胞中分别证实外源性和内源性PPDPF与SOS1存在相互作用
；随后通过构建SOS1敲除的PDAC细胞系（Miapaca2、、、HPAC）
，，结合MTT
、、、、克隆形成及软琼脂实验，，，，发现PPDPF过表达仅能促进SOS1野生型细胞的生长，
，，而对SOS1敲除细胞无显著影响，，表明SOS1是PPDPF发挥促瘤作用的必需因子；为进一步明确作用机制，，利用SOS1截短突变体结合 Co-IP实验，，，确定PPDPF主要与SOS1的REM和CDC25结构域相互作用
，，且GST pulldown实验证实两者直接结合；通过GEF活性实验观察到
，，
，EGF刺激后的PPDPF可增强SOS1 Cat域的活性，，提示 EGF可能诱导PPDPF发生功能改变；最后，，，，借助GTP结合实验和微量热泳动（MST）技术证实PPDPF 能结合GTP
，，且GEF活性实验进一步显示
，，仅GTP结合状态的PPDPF可增强SOS1 Cat域的活性，，，，未结合GTP的PPDPF无此效应
，
，
，，明确GTP负载是PPDPF调控SOS1的关键。
。
。。

（2）PPDPF的肿瘤促进功能需要GTP结合能力

通过质谱（MS）鉴定出PPDPF的GTP结合位点为丝氨酸 6（Ser6）和丝氨酸 7（Ser7）
。。参照先前研究
，，，，将这两个位点的丝氨酸突变为亮氨酸，，，，构建了三种突变体（S6L、、S7L 和 S6L/7L）
。。。。通过GTP结合实验检测突变体的GTP结合能力，，发现三种突变体的GTP结合能力均显著受损，，，其中PPDPF（S6L/7L）对GTP的亲和力最低。。。为明确这些突变体对RAS/MAPK信号通路的影响，，研究检测了过表达野生型 PPDPF（WT）或PPDPF（S6L/7L）的PDAC细胞中p-ERK和KRAS-GTP的水平，，结果显示，，，与过表达野生型PPDPF的细胞相比，，过表达PPDPF（S6L/7L）的PDAC细胞中p-ERK和KRAS-GTP的水平显著降低。
。。PPDPF（S6L/7L）几乎丧失了增强SOS1Cat的GEF活性的能力。。。此外，
，
，S6L/7L突变还削弱了PPDPF在体外和体内的促生长作用。。。综上
，
，，PPDPF的GTP结合能力是其通过RAS/MAPK信号通路发挥促肿瘤作用所必需的。。。

（3）GTP从PPDPF向SOS1的转移对PPDPF-SOS1轴的促肿瘤作用至关重要

通过GTP结合实验证实SOS1可结合GTP，，共孵育实验显示PPDPF-GTP与SOS1Cat作用后
，，，，PPDPF 结合的GTP减少而SOS1Cat结合的GTP增加，，
，，直接证明GTP转移；利用综合分析定位SOS1Cat中与PPDPF Ser6/7互作的GTP接收区域（Cat-R1：807–814，，
，Cat-R2
：896–909），，构建关键氨基酸突变体（SOS1Cat-R1/R2 等）
；通过Co-IP验证突变体与PPDPF的相互作用显著减弱，，GTP结合实验显示其GTP结合能力下降；Western blot和GEF活性实验表明，，，，突变体无法有效激活KRAS-GTP和p-ERK，，，，且在PPDPF-GTP存在时仍丧失GEF活性；功能实验（体外增殖、、、体内成瘤）显示突变体无促肿瘤作用
，，，，而野生型SOS1作用显著。。。。最终提出模型：EGF刺激下，
，PPDPF结合GTP并转移至SOS1，，，，增强其GEF活性
，，激活KRAS及下游信号。。

03参考文献

Ni QZ, Zhu B, Ji Y, et al. PPDPF Promotes the Development of Mutant KRAS‐Driven Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Regulating the GEF Activity of SOS1. Advanced Science. 2022, 10(2):2202448. doi: